Телефон: +7 (383)-235-94-57

РЕГИСТРАЦИЯ ГЛИКИРОВАННОГО АЛЬБУМИНА ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ ПОДЛОЖЕК НА ОСНОВЕ НАНОСТРУКТУРИРОВАННЫХ ПЛЕНОК СЕРЕБРА, РЕАЛИЗУЮЩИХ ЭФФЕКТ ГИГАНТСКОГО КОМБИНАЦИОННОГО РАССЕЯНИЯ

Опубликовано в журнале: Менделеев №4(4)

Автор(ы): Нечаева Наталья Леонидовна, Еременко Аркадий Вениаминович, Курочкин Илья Николаевич, Богинская Ирина Анатольевна, Афанасьев Константин Николаевич, Рыжиков Илья Анатольевич, Седова Марина Владимировна

Рубрика журнала: Аналитическая химия

Статус статьи: Опубликована 25 декабря

DOI статьи: 10.32743/2658-6495.2019.4.4.206

Библиографическое описание

Нечаева Н.Л., Еременко А.В., Курочкин И.Н., Богинская И.А. [и др.] РЕГИСТРАЦИЯ ГЛИКИРОВАННОГО АЛЬБУМИНА ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ ПОДЛОЖЕК НА ОСНОВЕ НАНОСТРУКТУРИРОВАННЫХ ПЛЕНОК СЕРЕБРА, РЕАЛИЗУЮЩИХ ЭФФЕКТ ГИГАНТСКОГО КОМБИНАЦИОННОГО РАССЕЯНИЯ // Менделеев: эл.научный журнал. –2019 – №4(4). URL: https://mendeleevjournal.ru/archive/4/206 (дата обращения: 19.09.2020). DOI: 10.32743/2658-6495.2019.4.4.206

Нечаева Наталья Леонидовна

науч. сотр. Института биохимической физики Российской академии наук,

РФ, г. Москва

Еременко Аркадий Вениаминович

канд. биол. наук, ст. науч. сотр. Института биохимической физики Российской академии наук, Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,

РФ, г. Москва

Курочкин Илья Николаевич

д-р биол. наук, ведущий науч. сотр. Института биохимической физики Российской академии наук, Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

РФ, г. Москва

Богинская Ирина Анатольевна

канд. техн. наук, ст. науч. сотр. Института теоретической и прикладной электродинамики Российской академии наук

РФ, г. Москва

Афанасьев Константин Николаевич

науч. сотр. Института теоретической и прикладной электродинамики Российской академии наук

РФ, г. Москва

Рыжиков Илья Анатольевич

канд. техн. наук, заведующий лабораторией Института теоретической и прикладной электродинамики Российской академии наук

РФ, г. Москва

Седова Марина Владимировна

канд. хим. наук, ведущий науч. сотр. Института теоретической и прикладной электродинамики Российской академии наук

РФ, г. Москва

 

GLIСATED HUMAN ALBUMIN REGISTRATION USING NANOSTRUCTURED SILVER SUBSTRATES FILMS REALIZING THE EFFECT OF SURFACE ENHANCED SCATTERING

 

Natalia Nechaeva

researcher in Institute for Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences,

Russia, Moscow

Arkadiy Eremenko

candidate of sciences, senior researcher in Institute for Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences, Lomonosov Moscow State University,

Russia, Moscow

Ilya Kurochkin

doctor habilitatus, leading researcher in Institute for Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences, Lomonosov Moscow State University,

Russia, Moscow

Irina Boginskaya

candidate of sciences, senior researcher in Institute for Theoretical and Applied Electromagnetics, Russian Academy of Sciences,

Moscow, Russia

Konstantin Afanasiev

researcher in Institute for Theoretical and Applied Electromagnetics, Russian Academy of Sciences,

Moscow, Russia

Ilya Ryzhikov

candidate of sciences, head of laboratory in Institute for Theoretical and Applied Electromagnetics, Russian Academy of Sciences,

Moscow, Russia

Marina Sedova

candidate of sciences, leading researcher in Institute for Theoretical and Applied Electromagnetics, Russian Academy of Sciences,

Moscow, Russia

 

Работа была выполнена при поддержке гранта РНФ№ 16-14--00209П.

 

АННОТАЦИЯ

Были проведены работы по регистрации спектров альбумина и гликированного альбумина человека с использованием планарных подложек на основе тонких пленок серебра, реализующих эффект гигантского комбинационного рассеяния (ГКР). Подложки были сформированы на стекле с использованием технологии электронно-лучевого вакуумного распыления серебра. Итоговые подложки представляют собой тонкие пленки со сложной наноструктурированной морфологией со среднеквадратичной шероховатостью не более 2 нм. Использование предложенных подложек позволило реализовать измерение спектров альбумина и гликированного альбумина человека при низких концентрациях до 10 мкг/мл. Полученные спектры характеризовались высокой интенсивностью. Массив спектров гликированного и негликированного альбумина был успешно дифференцирован с помощью метода анализа главных компонентов (МГК) в программной среде Unscrambler.

ABSTRACT

Work was carried out to record the spectra of albumin and glycated human albumin using planar substrates based on thin silver films realizing the effect of surface enhanced Raman scattering (SERS). The substrates were formed on glass using electron beam vacuum sputtering technology. The resulting substrates are thin films with complex nanostructured morphology with a mean square roughness of not more than 2 nm. The using of the proposed substrates made it possible to measure the spectra of albumin and glycated human albumin at low concentrations up to 10 μg / ml. The obtained spectra were characterized by high intensity. The array of spectra of glycated and nonglycated albumin was successfully differentiated using the principal component analysis (PCA) method in the Unscrambler software environment.

 

Ключевые слова: эффект гигантского комбинационного рассеяния, ГКР активные подложки, регистрация белков, гликированный альбумин.

Keywords: surface-enhanced Raman scattering, SERS materials, protein registration, glycated serum albumin.

 

Введение

Метод ГКР широко распространен для регистрации низких концентраций биологических аналитов. Наиболее часто используемыми типами систем, реализующими эффект ГКР, являются коллоидные растворы на основе наночастиц серебра, показавшие хорошую стабильность и воспроизводимость усиливающих свойств [1,5,7]. А перенос таких систем на планарные подложки с возможностью гибкого управления морфологией сможет расширить области применения метода. Использование технологии вакуумного распыления позволяет создавать планарные подложки на основе тонких пленок серебра с контролируемой морфологией, что позволяет формировать наноструктурированные самоорганизующиеся пленки. Такие пленки могут быть эффективно использованы для изучения и регистрации спектров ГКР биологических аналитов различных типов. Такие подложки были разработаны в [2].

Гликированный сывороточный альбумин является известным биомаркером сахарного диабета [6]. Определение таких гликемических маркеров затруднено, особенно в условиях стационара из-за строгих требований к чувствительности и воспроизводимости метода. Этот важный маркер может быть измерен различными способами. На сегодняшний день существует всего несколько работ о прямом определении гликированного альбумина [4]. Также всё большую популярность набирает объединение различных методов, например, импедансной спектроскопии в сочетании с иммуносенсорами [3] или комбинация ИК-Фурье-спектроскопии с методом нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) [8]. Такое сочетание методов обеспечивает лучшую селективность и чувствительность, но может сделать анализ более сложным и дорогим.

В этой статье была показана возможность использования несложной ГКР активной подложки на основе серебра для прямого анализа гликированного альбумина. Было впервые продемонстрировано разделение гликированного и негликированного альбумина на ГКР-активных субстратах на основе самоорганизующихся непрерывных серебряных пленок. Этот тип подложки был ранее предложен в работе [2]. Было показано, что морфология поверхности играет критическую роль в анализе белка, поскольку она обеспечивает достаточный уровень сигнала ГКР от раствора белков с низкой концентрацией.

Материалы и методы

Формирование подложек для реализации эффекта ГКР на основе тонких серебряных пленок со сложной структурированной морфологией было осуществлено с помощью электронно-лучевого распыления серебра в вакууме в вакуумной камере УВН-3 (АО«Кварц», Россия). Для распыления использовали источник высокочистого серебра (>99.99%, АО «МЗСС») в виде гранул размером до 3 мм. Использовались следующие параметры осаждения: скорость осаждения 20 нм/с, напряжение на катоде 8 кВ, ток пучка 5 мА, базовое давление в камере было ниже 5×10-6 Торр. Распыление проводили на стеклянные подложки (Delta Lab, Испания). Предварительная подготовка стеклянных подложек осуществлялась промывкой в изопропиловом спирте (> 95% чистоты, Sigma Aldrich, США) и последующей очисткой в плазме на остаточной атмосфере в вакуумной камере УВН-3 (АО «Кварц», Россия).

Полученные подложки и параметры их морфологии были тщательно изучены. Были определены параметры шероховатости поверхности. Для этих исследований использовался атомно-силовой микроскоп Solver (НТ-МДТ, Россия) с интегрированной программой обработки данных. Изображения поверхности были получены в полунепрерывном режиме с использованием кантилевера HA_NC/15 (ScanSens Gmbh, Россия).

Растворы гликированного альбумина человека (Sigma Aldrich, США) и альбумина (Sigma Aldrich, США) 1 мг/мл готовили в деионизированной воде, полученной с помощью системы Milli-Q (Merck group, Германия). Концентрация белков 10 мкг/мл была получена путем разбавления деионизированной водой Milli-Q. Аликвоты по 3 мкл наносили на серебряные ГКР подложки. Капли были высушены на воздухе. Спектры белков измеряли в области сухого вещества.

Спектры ГКР белков изучали с использованием спектрометра комбинационного рассеяния на основе конфокального микроскопа Alpha 500R (WITek Gmbh, Германия) с использованием объектива Zeiss Epiplan Neoflural 50X / 0.8. Длина волны возбуждающего лазера составляла 785 нм, мощность потока лазерного луча составляла 54 мВт. Время накопления одного спектра составило 60 секунд. Количество усреднений спектров 5. На каждом пятне белка были измерены 20 спектров после высыхания капли раствора. Всего для каждого белка было приготовлено по 5 капель.

Полученные спектры были обработаны в программе OPUS 7.5 (Bruker Company, Германия). Для всех спектров был выделен рабочий диапазон 300-1700 см-1, проведено вычитание базовой линии и осуществлена векторная нормировка на пик при 1010 см-1. Для статистической обработки полученных спектров применяли метод анализа главных компонентов (АГК) с использованием Unscrambler X 10.3 (CAMO Software, Осло, Норвегия).

Результаты и обсуждение

Результаты измерения морфологии серебряной подложки ГКР показаны на рисунке 1. Среднеквадратичная шероховатость пленки составляет 1,5 нм, что является достаточно малой величиной. В данном случае ГКР-эффект возникает благодаря присутствию микро-неоднородностей пленки. Хотя среднеквадратичное значение шероховатости низкое, пленка характеризуется присутствием особенностей морфологии, которые показаны на рисунке 2. Параметр шероховатости Rtm - это средняя максимальная высота профиля, она описывает значения микро-неоднородностей. Rtm составляет 7,1нм для представленных в работе ГКР активных подложек.

Микрогетерогенности возвышаются над поверхностью на высоту в несколько нанометров. В то же время расстояние между ними также составляет несколько нанометров. Параметр пространственной шероховатости Sm представляет собой среднее расстояние между неровностями профиля и равен 157,6 нм. Такая система микронеоднородностей на фоне гладкой пленки представляется самоупорядоченной и равномерно распределенной по поверхности подложки ГКР и может рассматриваться как потенциальный источник «горячих точек», которые локализуют электромагнитное поле и приводят к появлению эффекта ГКР.

Также существует проблема отвода тепла в обычных тонких самоупорядоченных пленках серебра вблизи порога протекания.

 

 

Рисунок 1. Атомно-силовое изображение поверхности пленки

 

Рисунок 2. Поперечное сечение поверхности серебряной пленки

 

Представленная серебряная ГКР-подложка с толщиной, равной 100 нм, является теплопроводящей, что позволяет измерять такие аналиты, как белки, при высокой мощности лазерного возбуждения.

Массивы ГКР спектров гликированного альбумина и альбумина человека были измерены и результаты измерений показаны на рисунке 3. Спектры характеризуются отличиями в полосах колебаний при 1633, 1456, 1038, 954, 905, 575, 515 см-1. Спектры были подвергнуты математической обработке.

 

Рисунок 3. Сравнение ГКР спектров альбумина (серый) и гликированного альбумина (черный) 

 

В таблице 1 приведена расшифровка полос колебаний спектров в соответствии с [9].

Таблица 1.

Колебательные моды ГКР спектров альбумина и гликированного альбумина человека

Волновое число, см-1

Полоса колебаний

1659

Амид-I

1608

Тирозин

1592, 1584

Фенилаланин

1456

Δδ(CH2)

1343

Δδ(CH)

1205

Тирозин, фенилаланин

1183

Тирозин

1133

ν(CN)

1031, 1005

P  Фенилаланин

954

Νν(CCN)сим, Νν(CC)

901

Ν ν(CC)

853

Тирозин

673

ν(CS)

ν -колебательные моды; и δ –деформационные.

 

Чтобы проверить способность наших ГКР активных подложек усиливать сигнал комбинационного рассеяния, был проведен контрольный эксперимент. Были получены спектры комбинационного рассеяния высушенного на воздухе раствора альбумина человека, нанесенного на стекло. Амплитуда такого спектра намного ниже, чем амплитуда спектра альбумина, измеренного на активной ГКР подложке. Усиление ГКР сигнала было рассчитано как отношение интенсивности полосы колебаний при 1005 см-1 альбумина, нанесенного на стекло и на активную ГКР подложку, и достигает значений до 103.

Способность субстратов усиливать сигнал возникает в результате сочетания механизмов: электромагнитного усиления, обусловленного нанодисперсностью субстрата, и химического усиления, обусловленного ионным взаимодействием молекулы белка с активной поверхностью серебра подложки.

Из рисунка 3 видно, что спектры альбумина и гликированного альбумина практически идентичны и характеризуются крайне незначительными отличиями, отвечающими за гликановые составляющие. В таких случаях для точного и быстрого разделения и идентификации спектров можно использовать метод анализа главных компонент (МГК). Результаты МГК обработки спектров гликированного (ГАЧ) и негликированного альбумина человека (АЧ) показаны на рисунке 4.

 

Рисунок 4. Результаты анализа МГК спектров альбумина (●) и гликированного альбумина (■)

 

На рисунке 4 показана четкая разница между облаками спектров, принадлежащих разным белкам. В трехмерном пространстве на рисунке 5 изображено расположение облаков спектров белков сразу для трех главных компонент: ГК-1, ГК-2 и ГК-3.

 

Рисунок 5. Трехмерное отображение результатов анализа МГК спектров альбумина (●) и гликированного альбумина (■)

 

Из рисунка видно, что облака спектров находятся на значительном расстоянии друг от друга.

Соответствующие графики нагрузок для всех представленных компонент показаны на рисунке 6.

 

 

 

Рисунок 6. Нагрузки для ГК-1, ГК-2, ГК-3

 

Анализ нагрузок показывает, что основной вклад в разделение спектров принадлежит особенностям спектров при 1663, 1479, 1307, 518 см-1 для компоненты 1; 1671, 1459, 1232 см-1 для компоненты 2 и 1660, 1467, 1230, 515 см-1 для компоненты 3.

Заключение

Серебряные подложки, реализующие ГКР эффект, были получены, исследованы и успешно применены для получения и разделения спектров белков гликированного альбумина и альбумина человека. Подложки сформированы электронно-лучевым испарением в вакууме и имеют сложную наноструктурированную морфологию. Мы показали возможность разделения гликированного альбумина и альбумина человека при использовании ГКР подложек, характеризующихся наличием микронеоднородностей. Были получены ГКР спектры белков с высоким разрешением колебательных полос даже при низких концентрациях белков в исходном водном растворе 10 мкг/мл. Массивы спектров были достоверно разделены с помощью анализа МГК.

 

ГКР - гигантское комбинаионное рассеяние

ГАЧ - гликированный альбумин человека

АЧ - альбумин человека

ГК- главная компонента

МГК - метод главных компонент

НПВО – нарушенное полное внутреннее отражение

 

Список литературы:

  1. Дурович Е.А., Евтушенко Е.Г., Сенько О.В. и др. Молекулярная природа ГКР-спектров суспензий E .coli при длинах волн возбуждения 532 и 785 нм с использованием золей наночастиц серебра в качестве ГКР-субстратов // Вестник Российского государственного медицинского университета.-   № 6. С. 27-35
  2. Boginskaya I.A., Sedova M.V., Baburin A.V. et al.SERS-Active Substrates Nanoengineering Based on e-Beam Evaporated Self-Assembled Silver Films // Appl. Sci. 2019. V.9. P. 3988-4002.
  3. Bohli N., Meilhac O., Rondeau P. et al. A facile route to glycated albumin detection // Talanta. 2018. V. 184. P. 507–512.
  4. Dingari N.C., Horowitz G.L., Kang J.W.et al. Raman spectroscopy provides a powerful diagnostic tool for accurate determination of albumin glycation // PLoS One. 2012. V.7. № 2. P. e32406
  5. Fabelinsky V. I., Kozlov D. N., Orlov S. N. et al. Surface‐enhanced micro‐CARS mapping of a nanostructured cerium dioxide/aluminum film surface with gold nanoparticle‐bound organic molecules // Journal of Raman Spectroscopy. 2018. V.49.№7. P. 1145-1154
  6. Koga M., Kasayama S. Clinical impact of glycated albumin as another glycemic control marker // Endocr. J. 2010. V.57. № 9. P. 751–762.
  7. Kurochkin I. N., Sarychev A. K., Ruzhikov I. A. et al. Surface-Enhanced Raman Scattering–Based Biosensors // Portable Biosensing of Food Toxicants and Environmental Pollutants,  Series in Sensors,  CRC PRESS-TAYLOR & FRANCIS GROUP (6000 BROKEN SOUND PARKWAY NW,STE 300, BOCA RATON, USA, FL, 33487-2742). 2013.  97-123
  8. Li Y., Li F., Yang X.et al. Quantitative analysis of glycated albumin in serum based on ATR-FTIR spectrum combined with SiPLS and SVM // Spectrochim. Acta - Part A Mol. Biomol. Spectrosc. 2018. V. 187.P. 201249–257.
  9. Movasaghi Z. Raman spectroscopy of biological tissues //Applied Spectroscopy Reviews 2007. V. 42. № 5.P. 493-541.